c BAB 7 MIKROSKOP


BAB 7

MIKROSKOP

7.1      PENDAHULUAN

Mikroskop adalah instrumen yang paling banyak digunakan dan paling bermanfaat di laboratorium mikroskopi. Dengan alat ini diperoleh perbesaran sehingga memungkinkan untuk melihat organisme dan struktur yang tak tampak dengan mata bugil. Mikroskop memungkinkan perbesaran dalam kisaran luas, dari seratus kali sampai ratusan ribu kali.

Anton van Leeuwenhoek adalah seorang yang dalam tahun 1675 diakui sebagai orang yang pertama kali melihat bakteri menggunakan suatu instrumen optik yang terdiri dari lensa-lensa bikonveks. Leeuwenhoek pada waktu itu berhasil menemukan bakteri di dalam berbagai cairan di antaranya cairan tubuh, air, ekstrak lada, dan bir. Penemuan mikroskop pada saat itu membuka peluang untuk dilakukannya penelitian-penelitian mengenai terjadinya proses fermentasi dan penemuan jasad renik penyebab penyakit.

Bagian-bagian mikroskop sederhana dapat dilihat pada Gambar 7.1. Berbagai jenis mikroskop dengan tingkat pembesaran maksimum dan ciri-ciri masing-masing dapat dilihat pada Tabel 7.1.

Gambar 7.1. Bagian-bagian Mikroskop Sederhana (Brock, 1974)

Kedua kategori mikroskop yang ada ialah mikroskop cahaya (atau optis) dan mikroskop elektron. Keduanya berbeda dalam prinsip yang mendasari perbesaran. Mikroskop cahaya yang kesemuanya menggunakan sistem lensa optik, mencakup mikroskop (1) medan-terang, (2) medan-gelap, (3) fluoresensi, dan (4) kontras-fase. Mikroskop elektron menggunakan berkas elektron sebagai pengganti gelombang cahaya untuk memperoleh bayangan yang diperbesar.

7.2      LENSA DAN PEMBESARAN

Pembesaran oleh suatu mikroskop merupakan hasil dari dua sistem lensa yaitu lensa objektif yang terletak di dekat objek, dan lensa okuler (eyepiece lens) yang terletak di bagian atas di dekat mata orang yang melihatnya seperti terlihat pada Gambar 7.2, lensa objektif bekerja mengatur fokus sinar lampu pada objek yang ditempatkan di belakang titik fokal F1 dan memperbesar objek sehingga menghasilkan bayangan nyata yang diproyeksikan pada bidang fokal dari lensa okuler. Bayangan nyata yang terletak di depan titik fokal F1 dari lensa okuler diperbesar oleh lensa okuler sehingga membentuk bayangan maya (bayangan semu) yang dapat dilihat oleh mata. Dengan demikian, total pembesaran merupakan hasil dari pembesaran lensa objektif dan lensa okuler. Lensa objektif terdiri dari kombinasi lensa konveks dan lensa konkaf.

Tabel 7.2. Perbedaan berbagai jenis mikroskop

Jenis mikroskop Pembesaran maksimum Penampakan objek penggunaan
Medan terang (Bright-field) 1000 – 2000

Objek diwarnai atau tidak diwarnai

Melihat morfologi, bakteri, khamir, kapang, ganggang, dan protozoa

Kontras

(Fase contrast)

1000 – 2000

Berbagai tingkat penggelapan/

kontras

Melihat struktur jasad renik yang berukuran relatif besar (sel khamir, ganggang, protozoa beberapa bakteri)

Medan gelap (dark field) 1000 – 2000

Objek terang atau bersinar dengan latar belakang

Melihat morfologi gelap jasad renik spesifik, misalnya spirokhita

Ultraviolet 1000 – 2000

Biasanya tidak dilihat langsung, tetapi diprotret atau ditangkap pada layar TV

Membedakan struktur sel berdasarkan daya serapnya terhadap sinar UV

Fluoresen 1000 – 2000

Terang dan berwarna fluoresen

Tehnik diagnosis untuk komponen fluoresen atau sel yang dapat dibuat menjadi fluoresen

Elektron 200 000-   400 000

Dilihat pada lempeng fotografik

Mengamati virus dan struktur sel yang sangat kecil (pili, DNA, dinding sel, membran, dsb)

Untuk memperoleh berbagai tingkat pembesaran, setiap mikroskop pada umumnya dilengkapi dengan tiga buah lensa objektif yang dipasang pada nosepiece yang dapat diputar, yaitu tediri dari :

  1. Lensa objektif berkekuatan rendah (low power, 16 mm) yang ditandai dengan angka 10x pada bagian luarnya dan mempunyai jarak kerja 5-8.3 mm.
  2. Lensa objektif berkekuatan tinggi (high dry, 4 mm) yang ditandai dengan angka 40x, 43x, 44x, atau 45x, dan mempunyai jarak kerja 0.46-0.72 mm.
  3. Lensa objektif minyak imersi (immersion oil, 1,8 mm) yang ditandai dengan angka 95x, 97x, atau 100x, dan mempunyai jarak kerja 0.13-0.14 mm.

Untuk mengatur fokus sistem lensa pada objek, digunakan dua buah knop yang dapat diputar yaitu knop pengatur kasar yang mengatur jarak antara lensa dengan objek, dan knop pengatur halus yang menggerakkan tabung penyangga lensa secara halus sehingga menghasilkan fokus yang tepat.

Gambar 7.2. Pembentukan bayangan oleh lensa objektif dan okuler pada mikroskop

Gambar 7.3. Hubungan antara jarak kerja lensa objektif dengan pengaturan    diafragma iris.

Angka 16 mm, 4 mm, dan 1.8 mm menunjukkan panjang fokal pada masing-masing lensa, yaitu jarak antara lensa dengan titik fokal lensa (F1 dan F2). Gambar 7.3 menunjukkan hubungan antara jarak kerja lensa objektif dengan pengaturan diafragma iris. Semakin pendek jarak kerja lensa, diafragma akan semakin terbuka. Jika lensa okuler mempunyai pembesaran 10x, maka total pembesaran harus dikalikan sepuluh kalinya, sehingga total pembesaran menggunakan lensa berkekuatan rendah menjadi 100x, dengan lensa berkekuatan tinggi pembesarannya adalah 400x, 430x, 440x atau 450, sedangkan pembesaran dengan lensa minyak imersi menjadi 950x, 970x atau 1000x.

7.3      RESOLVING POWER

 

Resolving power adalah kemampuan dari suatu lensa untuk melihat sebuah benda sebagai objek yang terpisah secara jelas. Sebagai contoh, resolving power mata manusia yang normal pada jarak 25 cm adalah 0.1 mm (100 mikron). Benda yang berukuran lebih kecil dari 100 mikron tidak dapat dilihat oleh mata secara terpisah tanpa menggunakan bantuan alat pembesar. Sifat resolving power lensa dipengaruhi oleh panjang gelombang sinar dan numerical aperture (NA) dari lensa. NA merupakan fungsi dari indeks refraksi dan sudut apertur lensa objektif :

                  NA  =  n sin q dan q = ½ a

Dimana :      n   =      indeks refraksi

a   =      sudut berkas sinar yang masuk ke lensa objektif

 

Resolving power    =   diameter objek terkecil yang terlihat

=   panjang gelombang

2NA

Resolving power berbanding terbalik dengan resolusi. Oleh karena itu, resolusi dapat dipertinggi dengan cara menurunkan resolving power yaitu menggunakan sinar dengan panjang gelombang yang lebih pendek, dan menaikkan NA dengan cara mempertinggi indeks refraksi antara objek dan lensa objektif, atau menaikkan sudut apertur (a) lensa objektif. Oleh karena itu, objek terkecil yang dapat dilihat melalui suatu mikroskop sederhana tergantung dari panjang gelombang terpendek dari sinar tampak (visible) dan lensa objektif yang mempunyai NA maksimum. Salah satu cara lainnya untuk menaikkan NA lensa adalah dengan menggunakan suatu kondenser. Kondenser yang baik akan menghasilkan resolving power dengan persamaan sebagai berikut :

Resolving power  =  panjang gelombang

2NA

Sebagai contoh, lensa kering mempunyai NA kurang dari 1.0, sedangkan lensa minyak imersi mempunyai NA lebih besar dari 1.0 yaitu 1.2 – 1.4, dan yang biasa digunakan misalnya mempunyai NA 1.25. Mata manusia paling sensitif trehadap warna hijau yang mempunyai panjang gelombang 500 nm. Oleh karena itu, resolving power menggunakan lensa minyak imersi dapat dihitung sebagai berikut :

Resolving power    =   500 nm  x 200 nm  =  0.2 mikron

2 x 1.25

Jadi, objek terkecil yang dapat dilihat dengan mikroskop biasa adalah 0.2 mikron. Pembesaran yang lebih tinggi untuk dapat melihat objek yang lebih kecil dari resolving power tidak akan berguna karena bayangan yang terbentuk akan terlihat kabur.

Udara mempunyai indeks refraksi n = 1, yaitu lebih kecil daripada indeks refraksi gelas objek. Oleh karena itu, sinar lampu yang datang melalui gelas objek ke udara akan direfraksi atau dibelokkan. Sinar yang hilang ini menurunkan NA dan resolusi lensa objektif. Jika di antara gelas objek dan lensa objektif diberi minyak imersi yang mempunyai indeks refraksi n = 1.5, yaitu sama dengan gelas crown yang digunakan untuk membuat lensa, kehilangan sinar dapat dicegah. Akibatnya, resolusi akan lebih tinggi dan bayangan dapat lebih jelas. Akibat lain dari penggunaan minyak imersi adalah panjang fokal menjadi diperpendek sehingga sudut apertur semakin besar. Oleh karena itu jarak antara lensa objektif dan objek harus diperpendek. Jumlah sinar yang tidak dapat ditangkap oleh lebsa objektif.

 

Gambar 7.4 Cara kerja lensa minyak imersi dalam mikroskop sederhana

(Pelczar dan Reid, 1972)

        Panjang gelombang sinar yang digunakan dalam suatu mikroskop pada umumnya tetap, oleh karena itu resolusi terhadap suatu objek pada umumnya hanya dipengaruhi oleh NA lensa obyektif yang digunakan, di mana semakin tinggi NA semakin besar resolusinya atau semakin kecil objek yang dapat dilihat.

7.4      ILUMINASI

 

Di samping lensa objektif dan okuler, dua elemen lainnya yang penting dalam mikroskop adalah lampu dan lensa kondenser. Walaupun sebagai sumber sinar untuk mikroskop dapat digunakan sinar matahari, tetapi biasanya digunakan sinar lampu tungsten karena warna, suhu, dan intensitasnya bersifat stabil dan dapat dikontrol dengan mudah. Adanya lampu dan kondenser akan mengatur oluminasi dari objek secara tepat. Besarnya sinar yang melalui lensa objektif berbeda untuk setiap jenis lensa. Jika pembesaran lensa objektif naik, jarak kerja lensa menurun, dan sudut apertur objektif bertambah. Oleh karena itu, dengan bertambahnya pembesaran, bertambah banyak sinar yang harus masuk ke lensa objektif. Besarnya sinar yang masuk diatur oleh diafragma iris yang terletak di antara kondenser dan lensa. Dengan lensa objektif berkekuatan rendah dan tinggi, diafragma iris tidak terbuka penuh karena apda pembesaran ini objek akan terlihat jelas jika sinar tidak terlalu pekat. Tetapi jika digunakan lensa objektif minyak imersi yang mempunyai pembesaran 95x atau lebih, maka jarak kerja adalah yang terpendek, dan diafragma iris akan lebih terbuka.

7.5      MIKROSKOP KONTRAS

 

Mikroskop kontras diciptakan pertama kalinya oleh Fritz Zernike yang mendapatkan hadiah Nobel dalam tahun 1953 untuk penemuannya tersebut. Mikroskop ini dapat digunakan untuk melihat sel-sel berukuran kecil tanpa diberi pewarnaan.

Pada mikroskop kontras, sumber iluminasi berupa seberkas sinar yang datang  melalui suatu cincin di dalam lensa kondenser. Pada lensa objektif dipasang suatu cincin fase yang akan mengubah fase sinar yang melaluinya sebanyak seperempat dari panjang gelombangnya. Sinar yang telah melewati objek dan tidak dibelokkan akan menembus cincin fase dan terlihat oleh mata sebagai sinar putih yang normal. Sinar yang melalui objek dengan indeks refraksi berbeda dengan medium di sekelilingnya akan dibelokkan dan mempunyai berkas sinar yang lebih panjang. Oleh karena itu, akan tiba pada okuler di luar fase. Karena perbedaan indeks refraksi antara sel dengan medium disekelilingnya, maka bayangan dapat terlihat secara lebih kontras. Pada kebanyakan mikroskop kontras, bayangan terlihat gelap dengan latar belakang terang.

7.6      MIKROSKOP MEDAN GELAP

 

Mikroskop medan gelap adalah suatu mikroskop dimana sistem kondensernya telah diubah sedemikian rupa supaya sinar yang datang dapat mencapai objek dari arah samping, sehingga sinar yang dibelokkan secara refleksi dan refraksi oleh objek yang akan terlihat. Sinar-sinar yang menyebar tersebut akan melalui lensa objektif, sehingga objek yang terlihat terang dengan latar belakang gelap. Penggunaan mikroskop medan gelap memungkinkan untuk melihat partikel atau sel yang ukurannya di luar batas resolusi mikroskop sederhana, misalnya dalam mengamati sel-sel berukuran kecil seperti Treponema pallidum, yaitu spirokhita yang menyebabkan penyakit sipilis yang tidak dapat dilihat dengan mikroskop biasa.

7.7      MIKROSKOP ULTRAVIOLET

 

Mikroskop ultraviolet dapat menghasilkan resolusi dan pembesaran yang lebih tinggi dibandingkan dengan mikroskop biasa. Hal ini disebabkan sinar UV mempunyai panjang gelombang yang lebih pendek yaitu 180 – 400 nm (biasanya digunakan 230 – 350 nm), sehingga akan menghasilkan resolusi sekitar dua kali lebih tinggi daripada mikroskop biasa. Karena sinar UV merupakan sinar tidak tampak, maka bayangan baru dapat dilihat dengan mencatatnya pada suatu lempeng fotografik menggunakan tabung pengubah bayangan, atau dengan memperlihatkan pada layar televisi setelah ditangkap oleh suatu tabung foto atau kamera televisi yang sensitif terhadap sinar UV.

7.8      MIKROSKOP FLUORESEN

 

Beberapa senyawa kimia dapat menyerap energi dari gelombang ultraviolet dan mengeluarkannya sebagai gelombang tampak dengan panjang gelombang yang lebih tinggi. Senyawa yang mempunyai sifat demikian disebut bersifat fluoresen. Mikroskop fluoresen dapat melihat suatu objek yang bersifat fluoresen yang disebabkan adanya senyawa fluoresen alami, atau objek tersebut telah diberi perlakuan dengan zat warna fluoresen. Pada mikroskop fluoresen, sinar yang dikeluarkan oleh objek dilewatkan melalui suatu penyaring yang ditempatkan di antara lensa objektif dan okuler, sehingga hanya sinar fluoresen yang akan terlihat.

Teknik mikroskop fluoresen sering digunakan untuk mengamati bakteri tuberkulosa dengan menggunakan zat warna fluoresen auramin O. Bakteri tuberkulosa akan mengikat zat warna tersebut dan terlihat terang dengan latar belakang gelap. Kebanyakan bakteri lainnya tidak dapat mengikat zat warna auramin O.

7.9      MIKROSKOP ELEKTRON

 

Mikroskop elektron berbeda dengan mikroskop biasa, karena digunakan elektron sebagai pengganti sinar, sedangkan sebagai lensa digunakan elektromagnet. Seluruh sistem dalam mikroskop elektron berpotensi pada keadaan vakum tinggi (Gambar 3.7). Mikroskop elektron mempunyai resolusi yang sangat tinggi, di mana objek yang dapat terlihat mencapai ukuran 0.001 mikron atau 1 mm. Objek yang dapat dilihat melalui mikroskop elektron harus tipis sekali. Sel-sel yang terlalu tebal harus diiris tipis menggunakan ultramikrotom setelah terlebih dahulu dikeringkan di dalam pelatur organik dan dicetak di dalam plastik untuk memudahkan pengirisan. Untuk mendapatkan kontras yang baik, objek yang telah diiris-iris diberi zat warna khusus untuk mikroskop elektron yaitu asam osmat, permanganat, uramium, lantanum, atau plumbum (Pb). Senyawa-senyawa ini terdiri dari atom-atom yang mempunyai berat atom tinggi. Oleh karena itu, dapat menyebarkan elektron dengan baik. Struktur sel yang diberi pewarna tersebut menjadi lebih kontras dan mudah dilihat.

Cara lainnya untuk memperoleh kontras yang baik pada mikroskop elektron adalah dengan cara pewarnaan negatif, dengan prinsip yang sama seperti pewarnaan negatif pada mikroskop biasa.

Komponen yang digunakan adalah yang tidak dapat menembus struktur tetapi menyebarkan elektron. Cara-cara lainnya misalnya dengan teknik replika karbon untuk mengamati permukaan sel, dan freezeetching.

Suatu mikroskop yang telah dikembangkan untuk mengamati struktur permukaan adalah “Scanning electron microscope” (SEM). Objek yang akan diamati mula-mula dilapisi dengan lapisan tipis logam berat seperti emas. Berkas elektron diarahkan pada objek dan ditatapkan (scan) bolak-balik. Elektron yang disebarkan oleh logam berat tersebut dikumpulkan dan akan mengaktifkan layar untuk membentuk bayangan. Dengan alat SEM ini hanya permukaan objek yang dapat dilihat, dan pembesarannya sangat bervariasi yaitu dari 15.000 sampai kira-kira 100.000 kali.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: