c BAB 8 ANALISIS KUANTITATIF MIKROBIOLOGI PADA LIMBAH PADAT

 

BAB 8

ANALISIS KUANTITATIF MIKROBIOLOGI PADA LIMBAH PADAT

8.1      PENDAHULUAN

Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan pen­ting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut. Beberapa cara dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa kelompok yaitu :

  1. Perhitungan jumlah sel
    1. Hitungan mikroskopik
    2. Hitungan cawan
    3. MPN (Most Probable Number)
  1. Perhitungan massa sel secara langsung
    1. Volumetrik
    2. Gravimetrik
    3. Kekeruhan (turbidimetri)
  1. Perhitungan massa sel secara tidak langsung
    1. Analisis komponen sel (protein, DNA, A IP, dan sebagainya)
    2. Analisis produk katabolisme (metabolit primer atau sekunder, panas)
    3. Analisis konsumsi nutrien (karbon, nitrogen, oksigen, asam amino, mineral, dan sebagainya).

Perhitungan massa sel secara langsung maupun tidak langsung jarang digunakan dalam uji mikrobiologi bahan pangan, tetapi sering digunakan untuk mengukur pertum­buhan sel selama proses fermentasi. Dalam perhitungan massa sel secara langsung, jumlah sel jasad renik dapat dihitung jika medium pertumbuhannya tidak mengganggu pengukuran. Sebagai contoh, dalam metode volumetrik dan gravimetrik, pengukuran volume dan berat sel dilakukan dengan terlebih dahulu menyaring sel-sel jasad renik. Oleh karena itu, jika substrat tempat tumbuhnya banyak me­ngandung padatan, misalnya bahan pangan, sel jasad renik tidak dapat diukur menggunakan metode volumetrik, gra­vimetrik, maupun turbidimetri. Perhitungan massa sel se­cara tidak langsung sering digunakan dalam mengamati pertumbuhan sel selama proses fermentasi, di mana kom­posisi substrat atau bahan yang difermentasi dapat diamati dan diukur dengan teliti.

Dalam bab ini akan dijelaskan cara perhitungan jumlah sel yang umum digunakan dalam uji mikrobiologi bahan pangan, yaitu hitungan mikroskopik (Direct Microscopic Counts), hitungan cawan (Total Plate Counts) dan MPN (Most Probable Number). Cara-cara perhitungan massa sel secara langsung dan tidak langsung dapat dilihat pada buku-buku mengenai Mikrobiologi Dasar, Mikrobiologi Umum, atau Fermentasi.

8.2      HITUNGAN MIKROSKOPIK

 

a. Metode Breed

Hitungan mikroskopik dengan metode Breed sering diguna­kan untuk menganalisis susu yang mengandung bakteri dalam jumlah tinggi, misalnya susu yang diperoleh dari sapi yang terkena mastitis yaitu suatu penyakit infeksi yang menyerang kelenjar susu sapi. Cara ini merupakan suatu cara cepat, yaitu menghitung bakteri secara langsung meng­gunakan mikroskop. Cara ini mempunyai kelemahan yaitu tidak dapat dilakukan terhadap susu yang telah dipas­teurisasi karena secara mikroskopik tidak dapat dibedakan antara sel-sel bakteri yang masih hidup atau yang telah mati karena perlakuan pasteurisasi.

Dalam metode ini, luas areal pandang (field) mikroskop yang akan digunakan harus dihitung terlebih dahulu. Hal ini dapat dilakukan dengan cara mengukur diameter areal pandang menggunakan mikrometer yang dilihat melalui lensa minyak imersi.

Untuk menghitung jumlah bakteri di dalam susu, se­banyak 0.01 ml susu dipipet dengan pipet Breed dan di­sebarkan di atas gelas objek sehingga mencapai luas 1 cm2, kemudian didiamkan sampai kering, difiksasi, dan diwarnai dengan biru metilen. Rata-rata jumlah bakteri per areal pandang mikroskop ditentukan setelah mengamati 10 sam­pai 60 kali areal pandang, tergantung dari jumlah bakteri per areal pandang. Sel-sel yang mengumpul dalam kelom­pok, dihitung jumlah sel yang terdapat di dalam kelompok tersebut, tetapi jika tidak mungkin dapat dihitung sebagai satu kelompok. Hasil perhitungan berdasarkan jumlah ke­lompok bakteri biasanya lebih mendekati hasil perhitungan jumlah bakteri menggunakan agar cawan. Pada sapi yang terserang mastitis, susunya biasanya mengandung sel-sel darah putih dalam jumlah tinggi. Setelah pewarnaan de­ngan biru metilen, sel-sel darah putih akan terlihat sebagai sel yang bulat atau berbentuk tidak teratur, berwarna biru dengan ukuran lebih besar daripada bakteri.

Mikrometer yang digunakan adalah mikrometer gelas Objek yang mempunyai skala terkecil 0.01 mm. Areal pan­dang mikroskop biasanya mempunyai ukuran 14-16 skala atau 0.14-0.16 mm. Beberapa mikroskop mungkin mem­punyai ukuran diameter areal pandang lebih dari 0.18 mm.

Luas areal pandang mikroskop   =   pr2 mm2

=    cm2

Di mana r = jari-jari (mm) arcal pandang mikroskop. Karena contoh susu yang disebarkan pada gelas objek se­luas 1 cm2 adalah 0.01 ml, maka:

Jumlah susu per areal pandang mikroskop   =    x 0.01 ml

=    x ml

Dengan kata lain, untuk mendapatkan 1 ml contoh susu dapat diperoleh dari 10 000/pr2 kali areal pandang mikros­kop. Angka 10.000/pr2 disebut juga faktor mikroskopik (FM), dan digunakan untuk mengubah jumlah bakteri per areal pandang mikroskop menjadi jumlah bakteri per ml.

Jumlah bakteri per ml = x jumlah bakteri per areal pandang

Jumlah bakteri per areal pandang dihitung dari rata-rata pengamatan areal pandang. Jumlah areal pandang yang harus diamati tergantung dari jumlah rata-rata bakteri per areal pandang, dan ditentukan sebagai berikut:

Jumlah rata-rata bakteri

per areal pandang

Jumlah areal pandang

yang harus diamati

< 0.5

0.5 – 1

1 – 10

10 – 30

> 30

50

25

10

5

Dilaporkan sebagai TBUD

(terlalu banyak untuk dihitung)

b. Metode Petroff – Hausser

Dalam metode Petroff-Hausser, hitungan mikroskopik di­lakukan dengan pertolongan kotak-kotak skala (Gambar 8.1), di mana dalam setiap ukuran skala seluas 1 mm2 terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0.04 mm2, dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil. Tinggi contoh yang terletak di antara gelas objek dengan gelas penutup adalah 0.02 mm. Jumlah sel dalam beberapa kotak besar dihitung, kemudian dihitung jumlah sel rata-rata dalam satu kotak besar. Jumlah sel per ml contoh dapat dihitung sebagai berikut:

Jumlah sel ml contoh=Jumlah sel per kotak besarx25 kotakxx 103

Jumlah sel/mm2

Jumlah sel/mm3

Jumlah sel/cm3 (ml)

Jumlah sel per ml contoh =Jumlah sel per kotak besar x 25 x 50 x 103

=  Jumlah sel per kotak besar x 1.25 x 106

Hitungan mikroskopik merupakan metode yang cepat dan murah, tetapi mempunyai beberapa kelemahan sebagai berikut:

  1. Sel-sel yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel­sel hidup. Oleh karena itu, keduanya akan terhitung.
  2. Sel-sel yang berukuran sangat kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, sehingga kadang-kadang tidak ter­hitung.
  3. Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam sus­pensi harus cukup tinggi, misalnya untuk bakteri mini­mal 106 sel/ml. Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung.
  4. Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel jasad re­nik di dalam bahan pangan yang banyak mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal ini akan meng­ganggu dalam perhitungan sel.

tinggi contoh

0.002 mm

satu kotak besar

(= 16 kotak kecil)

 

Gambar 8.1. Gelas objek dengan kotak-kotak skala pada hitungan mikroskopik menggunakan metode Petroff-Hausser

 

8.3      HITUNGAN CAWAN

 

Prinsip dari metode hitungan cawan adalah jika sel jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel jasad renik tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan di­hitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Me­tode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah jasad renik karena beberapa hal yaitu:

  1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung.
  2. Beberapa jenis jasad renik dapat dihitung sekaligus.
  3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi jasad renik karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu jasad renik yang mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik.

Selain keuntungan-keuntungan tersebut, metode hitungan cawan juga mempunyai kelemahan-kelemahan sebagai be­rikut :

  1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mung­kin membentuk satu koloni.
  2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda.
  1. Jasad renik yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kom­pak dan jelas, tidak menyebar.
  2. Memerlukan persia pan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung.

Dalam metode hitungan cawan, bahan pangan yang di­perkirakan mengandung lebih dari 300 sel jasad renik per ml atau per gram atau per cm (jika pengambilan contoh dilakukan pada permukaan), memerlukan perlakuan pe­ngenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri. Setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah di antara 30 sampai 300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal ya­itu 1:10, 1:100, 1:1000 dan seterusnya, atau 1:100, 1:10 000, 1:1000 000 dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan bufer fosfat, 0.85% NaCl, atau larutan Ringer.

Cara pemupukan dalam metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara yaitu metode tuang (Pour plate) dan metode permukaan (Ssurface/Spread plate). Dalam metode tuang, sejumlah contoh (1 ml atau 0.1 ml) dari pengenceran yang dikehendaki dimasukkan ke dalam cawan petri, ke­mudian ditambah agar cair steril yang telah didinginkan (47-50°C) sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya contoh menyebar rata. Pada pemupukan dengan metode permukaan, terlebih dahulu dibuat agar cawan kemudian sebanyak 0.1 ml contoh yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut, dan diratakan dengan ba­tang gelas melengkung yang steril. Jumlah koloni dalam contoh dapat dihitung sebagai berikut :

Koloni per ml atau per gr= jumlah koloni per cawan x

Untuk melaporkan hasil analisis mikrobiologi dengan cara hitungan cawan digunakan suatu standar yang disebut Standard Plate Counts (SPC) sebagai berikut :

  1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengan­   dung jumlah koloni antara 30 dan 300.
  2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupa­kan satu kumpulan koloni yang besar di mana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni.
  3. Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni.

Dalam SPC ditentukan cara pelaporan dan perhitungan koloni sebagai berikut :

  1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka yaitu angka pertama (satuan) dan angka kedua (de­simal). Jika angka yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua. Sebagai contoh, 1.7 x 103 unit ko­loni/ml atau 2.0 x 106 unit koloni/gr.
  2. Jika pada semua pengenceran dihasilkan kurang dari 30 koloni pada cawan petri, berarti pengenceran yang di­lakukan terlalu tinggi. Oleh karena itu, jumlah koloni pada pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasil­nya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di dalam tanda kurung.
  3. Jika pada semua pengenceran dihasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan petri, berarti pengenceran yang di­lakukan terlalu rendah. Oleh karena itu, jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung. Hasil­nya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan faktor pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya ha­rus dicantumkan di dalam tanda kurung.
  4. Jika pada cawan dari dua tingkat pengenceran dihasil­kan koloni dengan jumlah antara 30 dan 300, dan per­bandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari ke­dua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan dua, dilaporkan rata- rata dari kedua nilai tersebut de­ngan memperhitungkan faktor pengencerannya. Jika per­bandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih be­sar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil.
  1. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengen­ceran, data yang diambil harus dari kedua cawan ter­sebut, tidak boleh diambil salah satu. Oleh karena itu, harus dipilih tingkat pengenceran yang menghasilkan kedua cawan duplo dengan koloni di antara 30 dan 300.

8.4      METODE MPN (MOST PROBABLE NUMBER)

Berbeda dengan metode hitungan cawan di mana diguna­kan medium padat, dalam metode MPN digunakan me­dium cair di dalam tabung reaksi, di mana perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung Durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya digunakan tiga atau lima seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas yang digunakan juga lebih banyak.

Dalam metode MPN, pengenceran harus dilakukan lebih tinggi daripada pengenceran dalam hitungan cawan, se­hingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung satu sel jasad renik, beberapa tabung mung­kin mengandung lebih dari satu sel, sedangkan tabung lainnya tidak mengandung sel. Dengan demiklan, setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positif, sedangkan tabung lainnya negatif.

Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik di dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut. Grup jasad renik yang dapat dihitung de­ngan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan.

Dalam metode MPN, dari setiap pengenceran dimasuk­kan 1 ml masing-masing ke dalam tabung yang berisi medium, di mana untuk setiap pengenceran digunakan tiga seri tabung atau lima seri tabung. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, dihitung jumlah tabung yang positif yaitu tabung yang ditumbuhi jasad renik yang dapat ditandai dengan timbulnya kekeruhan. Misalnya pada pe­ngenceran pertama ketiga tabung menghasilkan pertum­buhan positif, pada pengenceran kedua dua tabung positif, pada pengenceran ketiga satu tabung positif, dan pada pengenceran terakhir tidak ada tabung yang positif. Kombinasinya menjadi 3, 2, 1, 0, dan jika diambil tiga pengen­ceran yang pertama kombinasinya akan menjadi 3, 2, 1. Angka kombinasi ini kemudian dicocokkan dengan Tabel MPN (Lampiran 2 s.d 4), dan nilai MPN contoh dapat dihitung sebagai berikut :

MPN contoh    =   Nilai MPN dari table  x

Tabel yang digunakan untuk menentukan nilai MPN dari tiga seri tabung berbeda dengan tabel untuk lima seri ta­bung. Kombinasi yang dipilih dimulai dari pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung positif, sedangkan pada pengenceran yang berikutnya ada tabung yang negatif. Kombinasi yang diambil terdiri dari tiga pe­ngenceran. Jika pada pengenceran yang keempat atau se­terusnya masih ditemukan tabung yang hasilnya positif, maka jumlah tabung yang positif tersebut harus ditambah­kan pada angka kombinasi yang ketiga sampai mencapai jumlah maksimum.

Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jum­lah jasad renik tertentu yang terdapat di antara campuran jasad renik lainnya. Sebagai contoh, jika digunakan Lactose Broth maka adanya bakteri yang dapat menfermentasi lak­tosa ditunjukkan dengan terbentuknya gas di dalam tabung Durham. Cara ini biasa digunakan untuk menentukan MPN koliform terhadap air atau minuman karena bakteri koli­form termasuk bakteri yang dapat menfermentasi laktosa.

8.5      METODE HITUNGAN TIDAK LANGSUNG

 

Salah satu cara untuk menghitung jumlah sel di dalam suatu bahan secara tidak langsung adalah dengan uji biru metilen. Uji biru metilen (BM) biasanya dilakukan terhadap susu, dan dapat memberikan perkiraan jumlah bakteri di dalam susu. Dalam uji ini ditambahkan sejumlah biru me­tilen ke dalam susu, kemudian diamati kemampuan bakteri di dalam susu untuk tumbuh dan menggunakan oksigen yang terlarut, sehingga menyebabkan penurunan kekuatan oksidasi-reduksi dari campuran tersebut. Akibatnya, biru metilen yang ditambahkan akan tereduksi menjadi putih metilen. Waktu reduksi, yaitu perubahan warna biru men­jadi putih, dianggap selesai jika kira-kira empat per lima dari contoh susu yang terdapat di dalam tabung (sebanyak 10 ml) telah berwarna putih. Beberapa penelitian melapor­kan perkiraan jumlah koloni yang diperoleh dengan metode hitungan cawan dengan waktu reduksi menggunakan me­tode biru metilen seperti terlihat pada Tabel 10.1. Semakin tinggi jumlah bakteri di dalam susu, semakin cepat ter­jadinya perubahan warna dari biru menjadi putih.

Tabel 8.1. Hubungan antara jumlah koloni menggunakan metode cawan

                 dengan waktu reduksi dalam uji biru metilen

Waktu reduksi biru metilen (jam)

Perkiraan jumlah koloni (x 104)

0.5 – 3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5 – 8

8

80 atau lebih

40

25

15

10

6

2.5

1

Metode biru metilen merupakan cara yang lebih cepat dibandingkan dengan metode hitungan cawan, dan lebih teliti karena bakteri yang terdapat dalam keadaan berkelompok di mana dalam metode hitungan cawan dihitung sebagai satu koloni, dalam metode BM hal ini tidak berpengaruh terhadap perhitungan jumlah bakteri.

Kelemahan metode BM adalah karena cara ini tidak praktis dilakukan terhadap susu yang mengandung bakteri hidup dalam jumlah sedikit, misalnya susu yang telah men­galami pasteurisasi, di mana dibutuhkan waktu yang lama sekali untuk mereduksi biru metillen. Kelemahan lainnya adalah karena dalam uji biru metilen diperlukan waktu pengamatan yang terus-menerus, yaitu paling sedikit se­lama enam jam. Dengan metode ini juga tidak dapat di­bedakan jenis bakteri yang terdapat di dalam susu, mi­salnya bakteri gram positif atau negatif, pembentuk spora, khamir, dan sebagainya.

8.6      TEHNIK PEMERIKSAAN JUMLAH BAKTERI DALAM BAHAN PANGAN

a.  ANGKA LEMPENG TOTAL (TOTAL PLATE COUNT)

Angka lempeng total adalah jumlah bakteri mesofil dalam tiap 1 (satu) ml atau 1 (satu) gram sampel makanan yang diperiksa.

Angka lempeng total suatu produk pangan dapat mencerminkan teknik penanganan, tingkat dekomposisi, kesegaran dan kualitas sanitasi pangan. Di samping itu dapat untuk evaluasi kualitas sanitasi bahan pangan yang secara praktis tidak mendorong adanya pertumbuhan mikrobia. Khusus untuk bahan yang masih segar angka lempeng total dapat dipakai untuk evaluasi perkiraan umur simpan.

Penentuan angka lempeng total tidak ada hubungannya dengan indikator adanya mikrobia patogen sebab sebagian besar atau semua bakteri yang tumbuh mungkin bukan bakteri patogen. Angka lempeng total rendah tidak selalu mencerminkan bahwa produk pangan tidak tercemar mikrobia patogen dan sebaliknya angka lempeng total tinggi tidak selalu menggambarkan produk pangan tersebut tidak aman. Sebagai contoh produk pangan hasil fermentasi mempunyai angka lempeng total tinggi. Berdasarkan hal tersebut di atas, tidak semua jenis makanan mempunyai standar angka lempeng total yang sama.

Sesuai dengan batasan di atas maka angka lempeng total berlaku untuk semua bahan pangan padat maupun cair termasuk minuman dan air minum dengan dasar pengujian melihat koloni bakteri aerob mesofil setelah sampel makanan ditanam pada media yang sesuai dan dieramkan selama 24 – 48 jam pada suhu 35-37oC.

Cara Pemeriksaan :

  1. Bahan pangan padat
    1. Ditimbang secara steril 10 gr bahan pangan.
    2. Ditambah 90 ml air pepton 0,1%.
    3. Dimasukkan ke dalam Blender steril dan diblender sampai bahan padat tersebut hancur seluruhnya. Lama menghancurkan antara 2 – 4 menit atau tergantung dari keras dan kenyalnya bahan pangan.
    4. Dibuat pengenceran bertingkat 10-2; 10-3; 10-4; 10-5 (kalau diperlukan dapat 10-6 dan seterusnya).
    5. Dari masing-masing pengenceran diambil 0,1 ml ditanam pada piring petri yang berisi agar Muller Hinton atau Agar Nutrient atau Agar Standar Plate count. Pada masing-masing pengenceran dikerjakan 3 kali penanaman.
    6. Dieramkan selama 24 – 48 jam pada suhu 35 – 37oC.
    7. Dihitung jumlah koloni kuman.
    8. Jumlah koloni kuman untuk masing-masing pengenceran adalah harga rata-rata dari jumlah koloni kuman hasil 3 kali penanaman.
    9. Penghitungan koloni kuman dianggap masih cukup akurat apabila jumlah koloni yang dihitung antara 30 – 300 koloni kuman pada setiap piring petri.
    10. Jumlah kuman dalam 1 gram bahan pangan = jumlah koloni (h) x 10 x faktor pengenceran x 10.

Contoh :   Jumlah koloni kuman rata-rata dari 3 kali penanaman = 25 koloni, pada pengenceran 103.

Angka lempeng total    = 25 x 10 x 103 x 10

= 25 x 105 CFU/gr

Bagan

10 gr        +           90 ml                                 diblender

Bahan pangan        air pepton 0,1%                       2-5 menit

diencerkan

10-2 s/d 10-5

0,1 ml

(3 kali)

Agar MH atau

Agar Nutrient atau

Agar Standar Plate count

24 jam

suhu kamar

hitung jumlah

koloni

Gambar  8.2. Skema pemeriksaan jumlah bakteri pada bahan pangan padat.

  1. Bahan pangan cair
    1. Diambil dengan pipet steril 10 ml bahan pangan cair dimasukkan dalam tabung steril.
    2. Ditambah 90 ml air pepton 0,1%.
    3. Dibuat pengenceran bertingkat dengan cara sebagai berikut :

(1)    Diambil 1 ml larutan (b) ditambah 9 ml air pepton 0,1%.

(2)    Diambil 1 ml larutan (1) ditambah 9 ml air pepton 0,1%.

(3)    Diambil 1 ml larutan (2) ditambah 9 ml air pepton 0,1%, dan seterusnya sampai diperoleh pengenceran yang sesuai.

  1. Dilakukan pemanasan pada piring petri yang berisi Agar Muller’ Hinton atau Agar Nutrient atau Agar Standar Plate count dengan Metode Plate Count yaitu cara hitung koloni kuman yang tumbuh pada agar di dalam piring petri.

Pada masing-masing pengenceran dilakukan 3 kali penamanan.

Untuk mendapatkan pertumbuhan koloni kuman yang menyebar sehingga mudah dihitung pada metode plate count ada beberapa cara penanaman yaitu :

(1)    Cara pour plate (penaburan)

Dari larutan yang telah diencerkan sesuai dengan kebutuhan diambil 1 ml dimasukkan ke dalam piring petri steril.

(a)   Telah disiapkan 20 ml Agar Muller Hinton atau Agar Nutrient atau Agar Standar Plate count di dalam tabung reaksi dan dipanaskan pada suhu sekitar 50oC di dalam penangas air atau dengan cara merebus tabung yang berisi agar tersebut sehingga agar dalam keadaan cair.

(b)   20 ml agar cair (a) dituangkan ke dalam piring petri yang telah berisi 1 ml larutan yang telah diencerkan. Goyangkan pelan-pelan supaya terjadi campuran yang meluas rata.

(c)    Dieramkan selama 24 – 28 jam pada suhu 35 – 37oC.

(d)   Dihitung jumlah koloni kuman.

(e)   Jumlah koloni kuman untuk masing-masing pengenceran adalah harga rata-rata dari jumlah koloni kuman hasil 3 kali penanaman.

(f)    Penghitungan koloni kuman dianggap masih cukup akurat apabila jumlah koloni yang dihitung antara 30 – 300 koloni kuman pada setiap piring petri.

(g)   Jumlah kuman dalam 1 ml bahan pangan cair = jumlah koloni (e) x faktor pengenceran.

Contoh : Jumlah koloni kuman rata-rata dari 3 kali pengenceran = 30 koloni, pada pengenceran 104.

Angka lempeng total       =   30 x 104

Catatan :

Untuk mendapatkan hasil yang baik pada cara pour plate harus diperhatikan :

(a) Selama mengerjakan piring petri dibuka seminimal mungkin untuk mencegah

kontaminasi.

(b)   Waktu yang diperlukan untuk menuangkan media sampai dengan mencampur tidak boleh lebih dari 20 menit supaya media tidak membeku.

(c)    Setelah media dituangkan di dalam piring petri yang berisi 1 ml bahan pangan cair yang telah diencerkan dikerjakan pencampuran dengan cara menggoyang pelan-pelan piring petri keempat arah paling sedikit 5 kali.

(d)   Diusahakan tutup piring petri tidak basah oleh media.

(e)   Setelah media menjadi padat tanaman dipindah ke dalam alat pengeram dengan suhu 35 – 37oC.

(2)    Cara Spread Plate (Perataan)

Dari larutan yang telah diencerkan sesuai dengan kebutuhan diambil 0,1 ml diteteskan pada permukaan media Agar Muller Hinton atau Agar Nutrient atau Agar Standar Plate count.

(a)   Tetesan diratakan ke seluruh permukaan agar dengan menggunakan batang gelas bengkok steril.

(b)   Dieramkan selama 24 – 28 jam pada suhu 35 – 37oC.

(c)    Dihitung jumlah koloni kuman.

(d)   Jumlah koloni kuman untuk masing-masing pengenceran adalah harga rata-rata dari jumlah koloni kuman hasil 3 kali penanaman.

(e)   Penghitungan koloni kuman dianggap masih cukup akurat apabila jumlah koloni yang dihitung antara 30 – 300 koloni kuman pada setiap piring petri.

(f)    Jumlah kuman dalam 1 ml bahan pangan cair = jumlah koloni (d) x 10 x faktor pengenceran.

Contoh : Jumlah koloni kuman rata-rata dari 3 kali penanaman = 35 koloni, pada pengenceran 103.

Angka lempeng total  = 35 x 10 x 103 = 35 x 104

Catatan :

Untuk mendapatkan hasil yang baik pada cara spread plate permukaan media Agar yang dipakai harus dalam keadaan kering.

(3)    Cara Drops (tetesan)

Dari larutan yang telah diencerkan sesuai dengan kebutuhan diambil 20 μl dengan mikro pipet dan diteteskan pada permukaan media Agar Muller Hinton atau Agar Nutrient atau Agar Standar Plate count.

(a)   Dieramkan selama 24 – 28 jam pada suhu 35 – 37oC.

(b)   Dihitung jumlah koloni kuman.

(c)    Jumlah koloni kuman untuk masing-masing pengenceran adalah harga rata-rata dari jumlah koloni kuman hasil 3 kali penanaman.

(d)   Penghitungan koloni kuman dianggap akurat pada seri pengenceran yang pertumbuhan koloninya tidak padat dan mudah dilakukan penghitungan.

(e)   Jumlah kuman dalam 1 ml bahan pangan cair =

Jumlah koloni (c) x  x faktor pengenceran.

Contoh : Jumlah koloni kuman rata-rata dari 3 kali penanaman = 30 koloni, pada pengenceran 104.

Angka lempeng total      =  30 x 50 x 104 CFU/ml

b.  Metoda MPN (Most Probable Number)

Metoda MPN adalah salah satu cara untuk menghitung jumlah E. coli atau Coliform di dalam air secara empiris. MPN diartikan sebagai jumlah perkiraan terdekat.

Untuk menghitung jumlah Coliform atau E. coli yang mempunyai sifat hampir sama yaitu berbentuk batang, bersifat Gram negatif, dapat meragikan laktosa dengan menghasilkan asam dan gas, perlu diketahui hal-hal yang berbeda, yaitu :

  1. Coliform yang terdiri dari beberapa macam bakteri sebagian besar termasuk dalam golongan kuman yang meragikan laktosa secara lambat, yaitu 2 kali 24 jam atau lebih. E. coli termasuk dalam golongan kuman yang meragikan laktosa cepat, yaitu 1 kali 24 jam.
  2. Coliform dapat meragi laktosa pada suhu 37oC. E. coli dapat meragi laktosa sampai suhu 44,4oC.
  3. E. coli pada uji IMVC (Indol, Metol merah, Voges-Proskauer, Citrat) menunjukkan hasil positif pada Indol dan Metol merah.

Cara pengambilan contoh air

  1. Disiapkan wadah steril dengan volume lebih dasri 100 ml yang tertutup misalnya : botol dengan tutup, atau tabung dari gelas yang dapat ditutup secara steril.

Catatan :

Apabila air yang akan diperiksa adalah air yang telah di Khlorinasi, botol yang digunakan diberi larutan 0,1 ml Na2S2O3 3% untuk tiap 100 ml contoh air sebelum disterilkan.

  1. Tutup botol dibuka pada saat akan diisi contoh air yang akan diperiksa.
  2. Setelah diisi air botol segera ditutup kembali seperti semula. Jumlah air yang diambil tidak kurang dari 100 ml dan di dalam botol masih tersisa ruang berisi udara.
  3. Cara pengambilan contoh air sesuai dengan asal air.
    1. Air dari kran :

(1)    Bersihkan bagian dalam dan luar dari kran dengan alkohol.

(2)    Kran dibuka dan biarkan air mengalir selama 2 – 3 menit.

(3)    Tampung air di dalam botol steril sebanyak ± 100 ml.

  1. Air dari pompa tangan :

(1)    Bersihkan permukaan saluran air pada pompa dengan alkohol atau menggunakan kapas yang dijepit dengan pincet, dicelup alkohol atau spiritus dan dibakar.

(2)    Pompa digerakkan selama 5 menit dan biarkan air mengalir.

(3)    Tampung air di dalam botol steril sebanyak ± 100 ml.

  1. Air dari sumur atau bak persediaan air :

(1)    Botol steril diikat pad aujung tongkat yang telah disipkan lebih dulu.

(2)    Tutup botol dibuka dan secara cepat botol dimasukkan ke dalam air dengan mulut botol menghadap ke bawah sampai sedalam ± 30 cm dan kemudian mulut secara perlahan-lahan diputar menghadap ke atas.

(3)    Bila volume air di dalam botol dipandang sudah cukup, botol segera diangkat dan ditutup kembali secara steril.

Catatan :

(a)   Apabila sumur cukup dalam contoh air diambil dari air yang ditimba dengan membersihkan timba dengan alkohol atau dengan cara dibakar seperti pada 4.b.1.

(b)   Apabila yang diperiksa air sungai atau air dari mata air yang mengalir pada waktu memutar mulut botol menghadap ke atas bersamaan dengan menggerakkan botol menentang arus.

  1. Contoh air yang akan diperiksa dimasukkan di dalam kotak es (portable ice box) dan segera dibawa ke laboratorium. Apabila lama pengiriman, mulai dari pengambilan sampai dengan dilakukan pemeriksaan di Laboratorium kurang dari 4 jam tidak perlu suhu dingin seperti di dalam almari es, tetapi cukup dijaga dalam keadaan dingin selama dalam perjalanan.

Cara pemeriksaan :

  1. Disiapkan 10 ml dan 5 ml media Lactose Broth (LB) dalam tabung reaksi besar (ukuran 30 – 50 ml) yang di dalamnya dimasukkan tabung reaksi kecil secara terbalik untuk mengetahui adanya gas.
  2. Diletakkan 4 kelompok tabung di dalam satu deret rak tabung :

(a)    kelompok pertama         : 3 tabung berisi 10 ml LB

(b)    kelompok kedua             : 3 tabung berisi 5 ml LB

(c)    kelompok ketiga             : 3 tabung berisi 5 ml LB

(d)      kelompok keempat       : 3 tabung steril

  1. Untuk masing-masing kelompok tabung dimasukkan contoh air yang diperiksa :

(a)    3 tabung kelompok pertama masing-masing ditambah 10 ml air

(b)    3 tabung kelompok kedua masing-masing ditambah 1 ml air

(c)    3 tabung kelompok ketiga masing-masing ditambah 0,1 ml air

(d)    3 tabung kelompok keempat masing-masing diisi 20 ml air dan dimasukkan tabung reaksi kecil secaa terbalik. Kelompok keempat fungsinya sebagai kontrol.

  1. Diencerkan 37oC selama 24 jam.
  2. Dilihat apakah terbentuk gas atau tidak dengan melihat adanya gelembung gas pada tabung reaksi kecil yang diletakkan secara terbalik.
  3. Dari tiap tabung yang ada gasnya diambil satu tetes dimasukkan dalam 5 ml media Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB) yang di dalamnya terdapat tabung reaksi kecil yang terbalik.
  4. Dieramkan 44oC selama 24 jam.
  5. Dilihat apakah terbentuk gas atau tidak. Adanya gas dicatat dari setiap kelompok 3 tabung.
  6. Hasil gas positif maupun negatif dari masing-masing kelompok 3 tabung dicocokkan dengan Index Tabel MPN. Maka didapat jumlah E. coli pada tiap 100 ml air.

Catatan :

Untuk menghitung jumlah Coliform di dalam air pada dasarnya sama dengan cara menghitung E. coli. Yang perlu diperhatikan adalah :

  1. Lama pengeraman pada penanaman di media LB adalah 48 jam pada suhu 37oC, untuk memberi kesempatan Coliform yang termasuk pemecah laktosa lambat.
  2. Setelah pada penanaman di media LB menunjukkan adanya gas, masih perlu ditanam pada BGLBB untuk mengurangi jumlah fase positif karena pertumbuhan kuman lain yang dapat menghasilkan gas (Sacharolytic – clostridia). BGLBB bersifat lebih selektif. Lama pengeraman di BGLBB 48 jam pada suhu 37oC.

Bagan

Gambar 8.3. Skema cara pemeriksaan jumlah Coliform dengan metode MPN

MPN INDEX AND 95%  confidence limits for various combination of positive and negative result when three 10 ml portions, three 1 ml portions and three 0,1 ml portions are used.

Nuber of giving po-                                                       MPN INDEX

sitive reaction out of

3 of 10 ml

Each

3 of 1 ml

Each

3 of 0,1 ml

Each

Per 100 ml
0

0

0

1

1

1

1

1

2

2

2

2

2

2

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

3

0

0

1

0

0

1

1

2

0

0

1

1

2

2

0

0

0

1

1

1

2

2

2

3

3

3

3

0

1

0

0

1

0

1

0

0

1

0

1

0

1

0

1

2

0

1

2

0

1

2

0

1

2

3

0 – 3

3

3

4

7

7

11

11

9

14

15

20

21

28

23

39

64

43

75

120

93

150

210

240

460

1100

2400

Dikutip dari :   Taras, M.J., 1971. Standart Method for The Examination of Water and Waste. Ed 13.

Contoh :

Pada pembacaan akhir setelah ditanam pada media BGLBB dieramkan pada suhu 44oC selama 24 jam didapat pembentukan gas pada :

(a)    2 tabung di kelompok pertama

(b)    1 tabung di kelompok kedua

(c)    1 tabung di kelompok ketiga

Maka setelah dicocokkan dengan MPN INDEX jumlah E. coli 20 kuman per 100 ml air.

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s

%d bloggers like this: